PCR – Los secretos detrás de la técnica que detecta el SARS-CoV-2 (COVID-19)

Nunca antes las siglas PCR habían sido tan mencionadas como en la época de la pandemia de la COVID-19 que ha afectado a millones de personas.

En esta entrada intentaré explicar de manera sencilla en que consiste esta técnica y su aplicación para la detección del SARS-CoV-2, cuya infección provoca la enfermedad de la COVID-19.

¿Qué es la PCR?

La PCR, cuyas siglas significan “Reacción en Cadena de la Polimerasa” del inglés “Polymerase Chain Reaction”, es una técnica utilizada para amplificar un fragmento específico de ADN. De este modo, se obtiene una gran cantidad de una región determinada de ADN a partir de proporciones pequeñas del mismo.

La PCR fue inventada por Kary Banks Mullis en 1983 y, desde entonces, ha evolucionado de tal manera que hoy en día es considerada una técnica esencial en laboratorios de biología molecular, puesto que para el estudio del ADN es necesario una abundante cantidad del mismo. De otra manera, sería prácticamente imposible su análisis.

Como vimos en una entrada anterior, el estudio del ADN es crucial para investigar acerca de cómo funcionan y cuál es la estructura de los genomas y genes.

¿Cómo se hace una PCR?

La amplificación del ADN es posible gracias a un tipo de enzima denominada ADN polimerasa, que de forma natural se encuentra en las células de todos los organismos vivos para replicar el ADN antes de cada división celular. De esta forma, a partir de una molécula de ADN se sintetiza una copia que se repartirá a cada una de las células hijas resultantes.

La PCR se lleva a cabo en una solución donde se encuentran una serie de componentes necesarios para que se produzca la reacción.

A continuación, se nombran los componentes de la reacción y pasos de esta técnica.

Componentes de la reacción

• Polimerasa termoestable: es una ADN polimerasa que produce nuevas cadenas de ADN complementarias a la cadena de ADN molde y capaz de resistir altas temperaturas. La más común recibe el nombre de Taq polimerasa.
• ADN molde: es el ADN contenido en la muestra a partir del cual se amplifica la región que nos interesa.
• Cebadores (o primers): son secuencias cortas de nucleótidos que proporcionan el punto de partida para la amplificación por parte de la polimerasa. Constituyen el componente clave de la reacción, puesto que se unen específicamente al ADN flanqueando la zona que queremos amplificar. Cada cebador se une a una cadena concreta del ADN (fig. 1)
• Nucleótidos (dNTPs): son los cuatro tipos de desoxirribonucleótidos que componen el ADN (A, T, G y C).
• Cloruro de magnesio: el magnesio actúa como cofactor de la polimerasa para que pueda ejercer su función.
• Solución tampón: sirve para regular el pH de la PCR. Sin él la polimerasa no funcionaría adecuadamente.
• Agua: la reacción se lleva a cabo en un medio líquido.
• Termociclador: es un aparato capaz de proporcionar la temperatura adecuada a la solución en cada momento. Para realizar la PCR se necesita variar la temperatura de la reacción en varias etapas.

Principio de la reacción

La PCR consiste en amplificar una región específica del ADN a partir de una serie de pasos que se repiten cíclicamente. De este modo, se generan copias del fragmento de manera exponencial, porque cada nueva copia obtenida en un ciclo sirve de molde para los siguientes ciclos. Como resultado, se obtendrán millones de copias del fragmento de ADN seleccionado.

Una vez mezclados los componentes, la reacción se produce en el termociclador siguiendo los pasos que se citan a continuación:

• Desnaturalización: el ADN molde se somete a 94ºC-96ºC durante 1-5 minutos para romper los enlaces tipo puente de hidrógeno que hay entre las dos hebras de ADN y separarlas.
• Amplificación: esta parte consta de tres pasos que se repiten de 30-40 veces de manera cíclica.
  1. Desnaturalización: se mantiene la temperatura entre 90-95ºC durante 30-55 segundos para mantener las hebras separadas.
  2. Hibridación: los cebadores se unirán de manera específica a la secuencia de ADN monocatenario obtenido en el paso anterior. La temperatura y tiempo dependerán de la longitud y secuencia del cebador, pero suele rodar de 50-65ºC con tiempos de 30-55 segundos.
  3. Extensión: la temperatura óptima de acción de la polimerasa es 72ºC. La polimerasa añadirá nucleótidos después de los cebadores de manera complementaria a la cadena de ADN molde monocatenaria. El tiempo dependerá de la longitud de ADN que queremos amplificar. Como regla general, la polimerasa necesita un minuto por cada 1000 pb a amplificar.

Una vez finalizado un ciclo, se repiten los pasos del 1-3 hasta completar el número de ciclos definidos.

• Extensión final: una vez acabados todos los ciclos, se deja la solución a 72ºC durante 5-10 minutos para que la polimerasa acabe de polimerizar los fragmentos que hayan quedado incompletos.

¿Es efectiva la PCR?

La PCR es una técnica usada comúnmente en los laboratorios, ya que posee las siguientes particularidades:

• Sensible: cantidad mínima de ADN necesaria para que se amplifique el fragmento de ADN.
• Específica: capacidad de amplificar una región concreta del ADN y no otra.

Todas las características anteriores hacen de la PCR una técnica sumamente efectiva a la hora del estudio y análisis del ADN.

¿Cuáles son las aplicaciones de la PCR?

Algunas de las aplicaciones de la PCR son las siguientes:

• Diagnóstico molecular:
  • Detección de patógenos para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.
  • Detección de enfermedades genéticas en el embrión o adulto.
• Genética forense: el análisis de la huella genética (o perfil de ADN o DNA fingerprinting), la cual es específica para cada persona, es usada para el test de paternidad, detección de sospechosos, análisis de restos humanos, etc.
• Mejora genética y animal: el análisis del perfil genético de especies animales y vegetales para la identificación de especies y variedades o detección de organismos transgénicos.
• Investigación: para el estudio de la localización, función o estructura de un gen u organización de un genoma. Además, se pueden analizar los patrones de expresión de genes, entre otros estudios.
• Biotecnología: desarrollo de transgénicos, terapias génicas, producción de proteínas, etc.
• Biología evolutiva: gracias al estudio del ADN podemos investigar las relaciones entre las especies, patrones de migraciones o secuenciar ADN de especies extinguidas.
• Identificación de especies: como por ejemplo, la detección de nuevas especies de microorganismos.
• Salud pública: detección de gérmenes en aguas, suelos, alimentos, etc.

¿Cómo funciona el test de PCR de la COVID-19?

El SARS-CoV2 es un virus de la familia del coronavirus que se caracterizan por poseer como material genético una molécula de ARN de cadena sencilla (ácido ribonucleico), en vez de ADN.

Para la detección del SARS-CoV-2 se usa una versión de la PCR denominada PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR). En esta técnica se añade un marcador fluorescente que permitirá detectar y cuantificar la cantidad de material genético que hay del virus en una muestra.

La detección del SARS-CoV-2 mediante la PCR detecta un fragmento específico de la secuencia del ARN del virus. Para ello, se siguen los siguientes pasos:

1. Retrotranscripción o transcripción inversa: la molécula de ARN se convierte a ADN.
2. PCR: se siguen los mismos pasos que en una PCR normal.
3. Análisis de resultados: el marcador fluorescente se une al ADN amplificado. De esta manera, es posible detectar y cuantificar la cantidad de ADN de la muestra con mayor sensibilidad que otros métodos.

Resultados de la PCR y su interpretación

• Resultado positivo: los cebadores detectan el fragmento específico de la secuencia del ARN del virus. Esto significa que el individuo del que procede la muestra está infectado.
• Falso positivo: si no hay virus la PCR no debería amplificar. Si amplifica el resultado es un falso positivo. Este resultado puede ser debido a contaminación cruzada o mal etiquetado de las muestras.
• Resultado negativo: si los cebadores no se unen con la secuencia específica del ARN del virus no habrá amplificación. Este resultado indica que en la muestra no hay virus.
• Falso negativo: sucede cuando una persona está infectada pero la PCR no indica presencia del virus. Esto podría suceder en estadios tempranos de la infección, cuando la cantidad de virus no es suficiente para que se produzca amplificación. También puede indicar que ha habido un mal etiquetado, mala toma, transporte o procesamiento de la muestra.

Otros test para detectar el SARS-CoV-2

• Detección de anticuerpos (o prueba serológica):
  • Detectan los anticuerpos generados por el organismo como respuesta de defensa a la infección del SARS-CoV-2.
  • Ofrece información de la respuesta inmunitaria del paciente, la cual incrementa a medida que avanza la enfermedad. Aproximadamente, a los 15-20 días es cuando se detectan anticuerpos en el 100% de los infectados.
  • Incluye test rápidos.
• Detección de antígenos:
  • Detectan proteínas virales expresadas por el SARS-Cov-2 presentes en el organismos a causa de la infección.
  • Las proteínas se expresan cuando el virus se replica activamente, así que solo se detectan infecciones agudas. Además, son menos sensibles que la PCR.
  • Son test rápidos.

Aunque existen otros métodos de detección, la PCR se trata del test de referencia para el diagnóstico de la infección por el virus SARS-CoV-2 según las autoridades sanitarias. Además, detecta positivos durante todas las etapas de la infección, incluso en las primeras fases, aunque los resultados tardan en procesarse.

Conclusiones

Para resumir, la PCR es una técnica esencial en los laboratorios de biología molecular debido a sus singularidades y múltiples aplicaciones, siendo una técnica muy sensible y específica que puede usarse para el análisis del ADN en el diagnostico de patógenos hasta utilizarse en estudios de evolución de especies.

En particular, durante la pandemia de la COVID-19, ha jugado un papel clave en la detección y control de la infección por el coronavirus.

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Referencias

• Gestoso-Pecellín, L. et al. (2021). Recomendaciones y uso de los diferentes tipos de test para la detección de infección por SARS-COV-2. Enfermería clínica, 31, 20-48.
• Rahman, M.T. et al. (2013). Polymerase chain reaction (PCR): a short review. Anwer Khan Modern Medical College Journal, 4(1), 30-36.
• Shahzad, S. et al. (2020). Polymerase Chain Reaction. En Genetic Engineering – A Glimpse of Thechniques and Applications, editado por Farrukh Jamal. London: IntechOpen.